วิธีปรับวิธี HPLC ให้เหมาะสมเพื่อการแยกและความแม่นยำที่ดีขึ้น

คู่มือทางเทคนิคสำหรับผู้จัดการห้องปฏิบัติการ ผู้พัฒนาวิธีการ และทีมจัดซื้อของ HPLC

การแยก HPLC ที่ดีกว่ามักไม่ได้มาจากการเปลี่ยนการตั้งค่าหนึ่งรายการโดยการสุ่ม เริ่มต้นด้วยการกำหนดคู่ที่สำคัญ ขีดจำกัดการรายงานที่จำเป็น และเกณฑ์การยอมรับ จากนั้นจึงเลือกคัดกรอง องค์ประกอบอินทรีย์ ค่า pH อัตราการไหล ปริมาณการฉีด และอุณหภูมิตามลำดับ สำหรับงานประจำ วิธีการแบบ isocratic ที่มีความเสถียรมักจะถ่ายโอนและตรวจสอบได้ง่ายกว่า เมื่อสารประกอบที่มีการชะช่วงปลายหรือช่วงขั้วที่กว้างทำให้เวลาในการทำงานมากเกินไป การไล่ระดับสีอาจเหมาะสม เป้าหมายเชิงปฏิบัติคือวิธีการแก้ไขจุดสูงสุดวิกฤตด้วยการกักเก็บและพื้นที่จุดสูงสุดซ้ำได้ โดยยังคงอยู่ภายในความดัน อุปกรณ์ตรวจจับ คอลัมน์ และข้อจำกัดตัวอย่างของเครื่องมือของคุณ

1. กำหนดปัญหาการแยกก่อนเปลี่ยนแปลงเงื่อนไข

บันทึกอาการ: การชะล้างร่วม การหาง การคั่งค้าง การดริฟท์ แรงดันย้อนกลับ การตอบสนองที่อ่อนแอ หรือระยะเวลาการทำงานที่มากเกินไป ระบุคู่จุดสูงสุดที่สำคัญต่อการตัดสินใจเผยแพร่หรือการวิจัย การปรับปรุงสิ่งเจือปนเล็กน้อยในขณะที่เสียสละคู่นั้นไม่ใช่การปรับปรุง

กำหนดเป้าหมายที่วัดได้: ความสามารถในการทำซ้ำของการเก็บรักษา ความแม่นยำของพื้นที่ ความละเอียดคู่วิกฤต การหาง เพลต และรอบเวลา บันทึกตัวอย่างตัวทำละลาย ความเข้มข้น ปริมาตรการฉีด ขนาดคอลัมน์ สารเติมแต่ง และความยาวคลื่น เพื่อให้สามารถแยกการเปลี่ยนแปลงการเลือกสรรออกจากความแปรปรวนของการเตรียมการได้

2. เปลี่ยนการเลือกก่อน: เคมีคอลัมน์, pH และตัวทำละลายอินทรีย์

หัวกะทิมักจะมีประโยชน์มากกว่าการปรับอัตราการไหลเล็กน้อย สำหรับการตรวจวิเคราะห์แบบรีเวิร์สเฟส ให้เปรียบเทียบเฟสที่อยู่นิ่งกับขนาดที่มีการควบคุมและขนาดอนุภาค C18 เป็นจุดเริ่มต้นที่มีประโยชน์ ไม่ใช่คำตอบสากล สารวิเคราะห์ที่เป็นพื้นฐาน เป็นกรด และมีขั้วสูงอาจต้องใช้เฟสหรือระบบสารเติมแต่งอื่น

ควบคุม pH ด้วยบัฟเฟอร์ที่กำหนด และตรวจสอบว่า pH สุดท้ายถูกวัดในส่วนประกอบที่เป็นน้ำที่ต้องการ การเปลี่ยนแปลงค่า pH เล็กน้อยสามารถเปลี่ยนไอออนไนซ์ของสารวิเคราะห์ได้ ดังนั้นจึงเกิดการเก็บรักษาและการเลือกสรร รักษาความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ ลำดับการเตรียม การกรอง และการเก็บรักษาให้สม่ำเสมอ หากวิธีการนี้ใช้สารเติมแต่งที่ระเหยได้ ให้ตรวจสอบความเข้ากันได้ของเครื่องตรวจจับและความสะอาดของแหล่งที่มาก่อนเปรียบเทียบผลลัพธ์

คัดกรองข้อมูลประจำตัวและสัดส่วนของตัวทำละลายแยกกัน อะซีโตไนไตรล์และเมทานอลสามารถแสดงความสามารถในการคัดเลือกที่แตกต่างกันที่ความเข้มข้นของการชะล้างที่ใกล้เคียงกัน เปลี่ยนทีละปัจจัยหรือใช้การออกแบบขนาดเล็ก แล้วยืนยันผลลัพธ์ด้วยเฟสมือถือใหม่ ตัวทำละลายที่แรงกว่าอาจทำให้การทำงานสั้นลงแต่จะบีบอัดคู่วิกฤต

3. เลือกการดำเนินการแบบ isocratic หรือแบบไล่ระดับอย่างจงใจ

ใช้การชะแบบไอโซคราติสเมื่อตัวอย่างมีช่วงการกักเก็บที่แคบ และการถ่ายโอนข้อมูลที่เรียบง่ายถือเป็นเรื่องสำคัญ การจัดองค์ประกอบอย่างต่อเนื่องช่วยลดความยุ่งยากในการปรับสมดุลและการแก้ไขปัญหา การชะล้างแบบไล่ระดับช่วยเมื่อพีคแรกต้องการสภาวะที่อ่อนแอ แต่สารประกอบตอนหลังจะสร้างหางที่ยาว มันเพิ่มตัวแปรคงอยู่และการปรับสมดุลใหม่

สำหรับงานแบบแยกส่วน ให้ปรับเปอร์เซ็นต์อินทรีย์รอบคู่วิกฤตให้เหมาะสม และตรวจสอบการรักษายอดแรกอย่างเพียงพอ สำหรับการไล่ระดับสี ให้กำหนดองค์ประกอบเริ่มต้น ความลาดเอียง การล้าง และเวลาการปรับสมดุลใหม่ หากปริมาตรคงที่ระหว่างเครื่องมือต่างกัน ให้จับคู่เวลาที่ทางเข้าคอลัมน์ แทนที่จะคัดลอกเฉพาะตารางที่ตั้งโปรแกรมไว้

4. ปรับอัตราการไหลและความดันภายในหน้าต่างควบคุม

อัตราการไหลส่งผลต่อประสิทธิภาพ ความดัน และเวลาวิเคราะห์ เริ่มต้นใกล้กับช่วงที่แนะนำของซัพพลายเออร์คอลัมน์ จากนั้นทดสอบหน้าต่างจากต่ำไปสูงที่แคบขณะรับชมความละเอียดและแรงดันต้าน การไหลที่ต่ำลงสามารถปรับปรุงประสิทธิภาพได้ในบางสภาวะแต่จะทำให้การวิ่งยาวขึ้น การไหลที่สูงขึ้นอาจเพิ่มปริมาณงานในขณะที่ประสิทธิภาพลดลงหรือเกินขีดจำกัดแรงดัน ถือว่าความกดดันเป็นเพียงข้อจำกัดในการปฏิบัติงาน ไม่ใช่เป้าหมายด้านประสิทธิภาพ

ChroMini HPLC LC-80MI มีช่วงอัตราการไหล 0.001-5.000 มล./นาที ความแม่นยำในการไหล <= +/-0.1% ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบที่ระบุ ความแม่นยำของการไหล RSD <=0.5% และความดันสูงสุด 5800 psi ค่าที่เผยแพร่เหล่านี้ช่วยกำหนดหน้าต่างคัดกรองด้านเครื่องมือ แต่ไม่ได้แทนที่การยืนยันว่าคอลัมน์ ความหนืด อุณหภูมิ และเฟสเคลื่อนที่ที่คุณเลือกยังคงอยู่ภายในขีดจำกัดที่ปลอดภัย บันทึกความดันที่วิธีการสุดท้าย หลังจากการปรับสมดุล และด้วยระบบที่สะอาด ดังนั้นการดริฟท์ในอนาคตจึงง่ายต่อการวินิจฉัย

5. จับคู่การฉีด การตรวจจับ และอุณหภูมิกับตัวอย่าง

ปริมาตรการฉีดและความแข็งแรงของตัวทำละลายสามารถสร้างการบังหน้า การแตกตัว หรือการทำให้พีคในช่วงต้นบิดเบี้ยวได้ เมื่อใช้งานได้จริง ให้ตัวทำละลายตัวอย่างไม่แรงกว่าเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้น ลดปริมาตรการฉีดสำหรับจุดสูงสุดที่รับน้ำหนักมากเกินไป และยืนยันความเข้มข้นเทียบกับช่วงการทำงานเชิงเส้นของเครื่องตรวจจับ เตรียมขวดจำลองจากสารละลายเดียวกันก่อนที่จะเปลี่ยนสภาวะโครมาโทกราฟี มิฉะนั้นความแปรปรวนในการเตรียมการอาจปลอมแปลงเป็นปัญหาการแยก

ตั้งค่าความยาวคลื่น UV จากสเปกตรัมของสารวิเคราะห์หรือวิธีการที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว ไม่ใช่จากค่าเริ่มต้นทั่วไป Wincom LC-80MI ระบุช่วงเครื่องตรวจจับรังสียูวีที่ 190-680 นาโนเมตร และแสดงความแม่นยำของความยาวคลื่น +/-1 นาโนเมตร และความแม่นยำต่ำกว่า 0.1 นาโนเมตร ข้อมูลเหล่านี้เป็นข้อเท็จจริงเกี่ยวกับเครื่องมือที่เป็นประโยชน์สำหรับการวางแผนวิธีการ ในขณะที่ความไวที่แท้จริงยังคงขึ้นอยู่กับการดูดซับของสารวิเคราะห์ ความเข้มข้น สภาวะโฟลว์เซลล์ และสัญญาณรบกวนในวิธีการที่สมบูรณ์

อุณหภูมิสามารถทำให้ความหนืดและการกักเก็บคงที่ได้ แต่ไม่ได้ช่วยแก้ปัญหาการเลือกสรรที่ไม่ดีโดยอัตโนมัติ ช่องคอลัมน์เทอร์โมสแตทของ LC-80MI เป็นอุปกรณ์เสริม ยืนยันช่วง ความเสถียร หลักฐานการสอบเทียบ และความเข้ากันได้กับคอลัมน์และเฟสเคลื่อนที่ของคุณก่อนที่จะระบุ

6. ตรวจสอบวิธีการปรับให้เหมาะสมด้วยการตรวจสอบความเหมาะสมของระบบและความทนทาน

หลังจากเลือกเงื่อนไขแล้ว ให้รันการฉีดมาตรฐานหรือความเหมาะสมของระบบซ้ำ กำหนดขีดจำกัดก่อนตรวจสอบผลลัพธ์ ติดตามความละเอียดของคู่วิกฤต ความสามารถในการทำซ้ำของการเก็บรักษา ความแม่นยำของพื้นที่ ส่วนท้าย และจำนวนแผ่น ฉีดช่องว่างสำหรับการยกยอดและการเตรียมเมทริกซ์ตัวแทนสำหรับการรบกวน

ทดสอบความทนทานรอบๆ จุดที่ตั้งไว้สำหรับเปอร์เซ็นต์อินทรีย์ pH การไหล อุณหภูมิ ความยาวคลื่น และปริมาตรการฉีด ใช้การเปลี่ยนแปลงที่สมจริงและระบุตัวแปรที่คุกคามผลลัพธ์ที่สำคัญก่อน ล็อตคอลัมน์เอกสาร การเตรียมเฟสเคลื่อนที่ ปริมาณการปรับสมดุล การกำหนดค่า และกฎการประมวลผล

⭐ แนะนำระบบ HPLC ขนาดกะทัดรัด | Wincom ChroMini HPLC LC-80MI

ChroMini HPLC LC-80MI ของเราเป็นระบบไอโซคราติกแบบครบวงจรที่รวมปั๊ม LC-80, อุปกรณ์ตรวจจับ UV80, ระบบหัวฉีดแบบแมนนวล 7725i, เวิร์กสเตชัน WS-80 และคอลัมน์ C18 5 µm ID 4.6×250 มม. การกำหนดค่าให้การควบคุมการไหล 0.001-5.000 มิลลิลิตร/นาที แรงดันสูงสุด 5800 psi และการตรวจจับรังสียูวีตั้งแต่ 190-680 นาโนเมตร

ใช้ หน้าผลิตภัณฑ์ ChroMini HPLC LC-80MI เพื่อตรวจสอบการกำหนดค่าที่แสดง จากนั้นส่งชื่อสารวิเคราะห์ เคมีคอลัมน์ สูตรเฟสเคลื่อนที่ ความเข้มข้น ปริมาตรการฉีด ความละเอียดเป้าหมาย และปริมาณงานตัวอย่างที่คาดหวังผ่านทางเรา หน้าการติดต่อ . จากนั้นเราสามารถยืนยันได้ว่าการกำหนดค่าที่เผยแพร่นั้นเป็นจุดเริ่มต้นที่เหมาะสม จำเป็นต้องใช้ช่องคอลัมน์เทอร์โมสแตทเสริมหรือไม่ และควรรวมเอกสารหรืออุปกรณ์เสริมใดบ้างในใบเสนอราคา

ตรวจสอบการเพิ่มประสิทธิภาพวิธีการได้อย่างรวดเร็ว

คำถามที่พบบ่อย:

เมื่อใดที่ฉันควรเปลี่ยนจาก isocratic เป็นการไล่ระดับสี HPLC

สลับเมื่อองค์ประกอบคงที่ไม่สามารถกักเก็บสารประกอบตั้งต้นไว้ได้อย่างเพียงพอ และชะล้างสารประกอบที่ล่าช้าในรอบเวลาที่เหมาะสม หรือเมื่อความสามารถในการคัดเลือกตลอดช่วงตัวอย่างยังคงต่ำ หากความเรียบง่ายในการถ่ายโอนและความทนทานตามปกติมีอิทธิพลเหนือ ให้คงวิธีการแบบแยกส่วนตรงที่ตรงกับเป้าหมายคู่วิกฤต เราสามารถตรวจสอบการไล่ระดับสีที่นำเสนอด้วยขนาดคอลัมน์ ปริมาตรการคงตัว และข้อกำหนดการปรับสมดุลใหม่ได้ผ่านทาง หมวดหมู่อุปกรณ์ HPLC .

LC-80MI สามารถรองรับวิธีการที่ต้องการการตรวจจับรังสียูวีที่ต่ำกว่า 200 นาโนเมตรได้หรือไม่

ช่วง UV80 ที่เผยแพร่คือ 190-680 นาโนเมตร ดังนั้นวิธีการที่ต้องใช้ความยาวคลื่นในช่วงนั้นจึงอยู่ภายในช่วงเครื่องตรวจจับที่ระบุไว้ ยืนยันการตอบสนองของสารวิเคราะห์ การดูดกลืนแสงเฟสเคลื่อนที่ สภาวะโฟลว์เซลล์ และการยอมรับสัญญาณรบกวนด้วยการทดสอบความเหมาะสมของระบบ ก่อนที่จะดำเนินการตามวิธีการที่ได้รับการตรวจสอบ ดู ข้อมูลจำเพาะ LC-80MI .

คอลัมน์ C18 ที่ให้มาเหมาะสำหรับการทดสอบ HPLC ทุกครั้งหรือไม่

ไม่ คอลัมน์ C18 5 µm, 4.6×250 มม. ที่ระบุไว้เป็นการกำหนดค่าเริ่มต้นที่กำหนดไว้ ไม่ใช่ข้อพิสูจน์ความเข้ากันได้ของสารวิเคราะห์สากล ระบุขั้วของสารวิเคราะห์, pKa, เมทริกซ์, ความละเอียดของเป้าหมาย และตัวทำละลายที่ถูกจำกัด เพื่อให้เราสามารถยืนยันได้ว่าคอลัมน์ที่ให้มามีความเหมาะสมหรือควรอ้างอิงเฟสคงที่อื่น เริ่มกันที่ ช่วงอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ และระบุเงื่อนไขเหล่านั้นในการสอบถามของคุณ